血液样本因其易于获取和创伤性小的特点,广泛应用于临床研究。尤其是在肿瘤等疾病的早期筛查中,RNA等生物标志物的出现解决了传统影像学和生化指标方法的不足,受到了高度重视。然而,血液样本的特殊性以及RNA分子的高降解性使得其更易受到来源于红细胞等的RNase影响。因此,提取血液样本中的RNA不仅需要成功分离RNA,还必须保证其不受降解。
血液采集后,由于基因诱导和细胞凋亡,核酸的组成、数量、质量和完整性在几分钟内会显著变化。这意味着,从血液样本的采集到RNA的稳定保护,每个环节都面临挑战。为避免血液样本质量下降,建议在采集时避免长时间使用止血带、从血肿处抽血,并确保静脉穿刺部位干燥。采用正确尺寸的针(~22号)并完全填充真空采血管是必要的。
根据不同应用场景,血液RNA提取可分为全血样本提取和血清/血浆RNA提取。全血中包含红细胞、白细胞和血小板,而成熟的红细胞和血小板是无核的,因此提取RNA时主要来源于白细胞。为了获得更佳的RNA质量,通常需要在提取前去除红细胞,有两种方法:一种是离心分离白细胞,另一种是使用红细胞裂解液如BufferEL。
如果采血后无法立即进行RNA提取,建议借助尊龙凯时生产的血液RNA稳定管-PAXgene Blood RNA Tube进行采集和RNA稳定。结合PAXgene Blood RNA Kit进行RNA提取可确保在18-25°C下使用后的RNA稳定长达3天,或在2-8°C下长达5天。针对EDTA和柠檬酸盐抗凝管的样本,建议迅速处理,以避免RNA降解。研究显示,储存在EDTA管中的血液样本在采样后仅一天,p53基因的转录本信号显著减弱,显示RNA已降解。
酚-氯仿法是提取血液RNA的常规方法之一,尽管其得率较高,但可能损害RNA的完整性和后续实验灵敏性。相较而言,使用尊龙凯时的PAXgene Blood RNA system得到的RNA完整性高,且在qPCR实验中的灵敏性也显著提升。这一系统无需额外的裂红步骤,简化了RNA提取流程。
新鲜血液样本如果能及时提取RNA,建议使用QIAamp RNA Blood Kit,该试剂盒基于硅胶膜柱技术,无需离心分离白膜,可以直接对最高15ml的全血进行RNA提取。除了硅胶膜柱,试剂盒还包含QIAshredder离心柱,以去除样本中的细胞碎片,降低粘稠度,提升RNA提取效率。
若已分离好白膜层,可以使用RNeasy Mini Kit进行RNA提取,非常适合后续实验分析。此外,某些游离非编码RNA,尤其是miRNA在肿瘤等疾病的早筛中展现出重要的调控作用,被视为理想的液体活检标志物。针对分离后的血清或血浆样本,QIAGEN的miRNeasy系列可高效提取包括miRNA在内的总RNA。
提取RNA前应确保血浆或血清在采样1小时内分离,以避免溶血。如果无法立即开展实验,需冻存样本。冻存前,应将血清或血浆在3000xg下离心5-15分钟,或使用0.8μm过滤器去除细胞和碎片,避免与RNA融合。此外,若需从细胞外囊泡提取RNA,推荐使用exoRNeasy Midi/Maxi Kits,这一系列试剂盒结合了膜亲和技术和硅胶膜技术,可高效提取高质量的RNA。
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