**SV40转染人成骨细胞HFOB119培养指南**

一、细胞培养条件

**细胞名称**: SV40转染人成骨细胞HFOB119

**生长特性**: 贴壁生长

**冻存条件**: 使用无血清冻存液（货号：C7001）

**培养体系**: DMEM/F12 + 0.3 mg/ml G418 + 10% FBS

**传代方法**: 建议第一次传代比例为1:2

**传代情况**: 每2天更换培养液

**备注**: 请使用无菌离心管收集培养基，留作过渡对比培养。若对比培养效果不理想，建议直接购买我们的完全培养基。

二、细胞处理

收到细胞后，待细胞培养至良好状态后，用完全培养液灌满瓶子并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。收到细胞后，请用75%酒精对细胞瓶进行喷洒消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。

将细胞瓶置于335℃、5% CO₂的培养箱中静置3-4小时，以使细胞状态稳定，再进行后续操作。使用显微镜观察细胞的生长状态，并记录不同倍数的照片（最好40x、100x和200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，若不提供照片则默认细胞状态良好。

（传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自行配制的完全培养基，以便进行对比培养，换液后适当松开瓶盖）

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞未超过80%汇合度，将瓶中完全培养液收集至离心管中，同时留5ml完全培养基于335℃、5% CO₂孵箱中培养；若细胞密度超过80%，请按以下步骤进行传代：

1. 丢弃培养上清，并用不含钙镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于335℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化情况。当细胞大部分变圆并脱落时，迅速取出，轻轻敲击培养瓶并添加5ml完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞以确保完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，添加1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 根据1:2比例将细胞悬液分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，然后放入335℃、5% CO₂的细胞培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液并用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使之脱落，转移悬液至15ml离心管中，并在1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，若后期需要转入液氮罐，请在-80℃下存放24小时后再转入液氮罐。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（请佩戴防护面具），迅速放入335℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶，随后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放于335℃、5% CO₂培养箱中继续培养。
4. 第二天，换用新鲜的完全培养基，继续培养。

四、注意事项

部分细胞在运输过程中可能会因贴壁不牢而脱落，这属于正常现象。如果遇到细胞脱落较多，请将培养瓶中的所有培养液收集至离心管，使用1000rpm离心5分钟，将上清液整理作过渡培养后，沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打以重悬，消化1-2分钟后再用5ml完全培养基终止反应，重离心并弃去上清后，补充1-2ml完全培养基重悬细胞。然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新培养基至5-8ml/瓶，再次放入335℃、5% CO₂培养箱中培养。

五、售后条款

1) 细胞出现问题，可重发的情况包括：在运输过程中遇到的各种问题，细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等；细胞污染问题需在收到产品48小时内提出真实实验结果，核实后可重发；常温发货细胞静置24小时后、干冰发货的细胞复苏后24小时未存活，需提供真实清晰的细胞状态照片；干冰发货的细胞复苏后24小时内，或常温发货静置4小时未开封出现污染，均可重发。

2) 细胞出现问题，不予重发的情况包括：客户造成的细胞污染；客户操作不当导致细胞状态不佳；使用非本库推荐的细胞培养体系导致的细胞状态不良等。具体情况将依据提供的照片和实验结果进行判定。